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干货 | 免疫原的设计策略
人阅读 发布时间：2020-06-10 17:22
前言
抗体（antibody）是指机体由于抗原的刺激而产生的具有保护作用的蛋白质，是由浆细胞分泌并参与体液免疫的重要分子。众所周知，抗体被广泛用于基础科学研究、病理诊断、检测试剂盒和药物的研发。
针对不同应用的抗体来设计不同的抗原是抗体开发的关键第一步。抗原，是指能够刺激机体产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合，发生免疫效应（特异性反应）的物质。
为研发生产最优质的抗体，华安生物的小伙伴在设计上经过无数次的摸索，积累了多年经验。今天，小编就将免疫原设计策略分享给大家~
常用的免疫原有很多种，如多肽、蛋白、小分子、核酸、糖类及细胞等，但如今最常见的免疫原还是以多肽和蛋白为主。
根据抗体的应用不同，我们对免疫原的设计策略也有所不同。
01. 应用于基础科学研究的抗体研发
该类抗体的免疫原一般设计为多肽或制备蛋白的片段。目前有不同网站可以用于参考设计多肽，该免疫原设计需考虑多肽亲水性、免疫反应性及种属特异性这三点。如 http://tools.iedb.org/main/, 该网站列出了 B 细胞表位，T 细胞表位的预测。
图 1：蛋白的 B 细胞表位预测图，不同的片段其 B 细胞表位的免疫反应性有差异，其中黄色区域的表示有一定的免疫反应
通过比对不同种属的蛋白序列来比较种属特异性，以便测试设计的多肽在不同种属中的差异。
图 2：HSP27 人蛋白，小鼠蛋白和大鼠蛋白的序列比对
通过序列比对图，我们可以根据最终的抗体要求，进行序列设计。若需要抗体能同时识别不同种属，设计时则优先考虑序列一致的区域；若只需要抗体能特异性识别人蛋白或是小鼠蛋白，设计时就需要找出特异性的片段。图中*表示氨基酸在不同种属中是一致的。
图 3：蛋白的三位结构，该蛋白的三维结构，有折叠区，也有线性区域
蛋白三维结构在多肽设计考虑中也是至关重要的。常见的 B 细胞抗原表位一般会选择线性区域，而非折叠区域或螺旋区域。但 T 细胞抗原表位设计则需考虑蛋白的空间构象，将目的区域的关键氨基酸设计成多肽。
Tips：通过不同的软件或是预测网站进行多肽设计后，根据研究目的，确定所研发的抗体需要特异性识别该蛋白，或是能识别该蛋白的同源蛋白，进行序列 blast。根据 blast 的结果，预先判断所设计的多肽的同源性。
02. 应用于针对修饰性位点的抗体研发
蛋白质的翻译后修饰对生命活动有着重要作用，如磷酸化，乙酰化，甲基化等。针对该类抗体研发，设计免疫原的策略主要是设计相应的修饰位点多肽。
首先找到修饰位点，如磷酸化，根据磷酸化位点附近的氨基酸序列，设计 15-20 个氨基酸的多肽，应用软件或网站预测该磷酸化位点附近的多肽的免疫反应性，挑选反应性最高的序列作为免疫原，并进行种属特异性的检查和非同源蛋白的比对。在合成含修饰位点的多肽的同时，也需要合成该位点无修饰的多肽用于交叉检测，最终获取针对特异性位点的抗体。
Tips: 根据研究目的的不同，有时需要抗体既可识别修饰后的蛋白，又可识别无修饰的蛋白，即 pan 抗体。针对这类抗体，筛选时需要能识别两种多肽。
03. 应用于试剂盒配对用抗体
试剂盒配对用抗体通过识别蛋白不同表位来检测样品中目的蛋白的含量。因此设计此类免疫原应先调研该蛋白的整体结构、整个蛋白的大小以及是否含有剪切片段；进而根据调研的信息设计蛋白片段。或制备全长蛋白，或制备蛋白片段。抗体筛选根据阳性抗体进行表位预测，针对不同表位的抗体进行配对检测，最终获取需要的抗体对用于试剂盒后期的研发。
图 4：针对 M1102 项目蛋白免疫并获取的单克隆抗体
该实验用 6B9 作为竞争抗体。实验结果显示：克隆 A5A7 与 A4A8 的结合位点与 6B9 不同；克隆 A3F5 的结合位点与 6B9 类似；克隆 A4A7 的结合位点与 6B9 有部分相似。因此我们在进行配对实验的时候，可以优先挑选结合位点不同的抗体进行配对，如 6B9-A4A8, A4A7-A4A8 等。
04. 应用于抗体药物的研发
抗体药物的研发指针对不同的药物靶标，进行大量的抗体药物前提的研发。
用于药物研发的抗体，免疫原设计要求更为严格，目前免疫阶段采用真核表达的蛋白。抗体药物靶标主要分为两类，分泌型靶标（VEGF, IL-6, IL-17 等）和跨膜蛋白（PD-1， BCMA, EGFR 等）。
分泌型靶标，一般直接制备真核表达的蛋白用于免疫。蛋白制备后对所表达的蛋白进行功能性实验的检测、细胞的增殖作用以及与相应配体的结合实验等，以确保所制备的免疫原是有活性的蛋白。
跨膜蛋白，所制备蛋白的策略会有不同，如下图所示。
图 5：蛋白的跨膜结构
图 6：蛋白胞外区的不同结合结构域示意图
上图蛋白为 I 型膜蛋白，胞外区为蛋白的结合区，胞内为蛋白的活性区域。在设计免疫原的时候，有两个策略。一是设计胞外的结合区，制备蛋白；二是用过表达该蛋白的细胞作为免疫原。设计免疫原后，利用相应的需要设计检测的蛋白进行抗体的筛选。有时蛋白的胞外区会有不同的结构域，如 IgC 结构域，α亚基，β亚基等（图 4），针对此类蛋白，根据文献，可以找出最重要的结合结构域制备蛋白。最佳策略是制备胞外区的片段以及含特殊结构的蛋白用于免疫，效果更佳。
Tips：利用过表达细胞进行免疫，可以使蛋白以天然状态展示在细胞表面，并结合蛋白筛选和细胞筛选，这样得到的抗体，其结合活性更佳。
05. 其他特殊的抗体
对于不同研究目的需制备不同的抗体。如针对特殊结合位点的抗体研发。
图 7：某蛋白与小分子的结合示意图。
小分子与该蛋白的结合位点为一边是折叠区尾部结构，一边是线性区域，而且该小分子与蛋白的其他部分无接触。因此，设计免疫原主要以线性表位为主，同时根据折叠区和线性表位的距离，设计 T 细胞表位的多肽。
同时，有些蛋白有原始形态和剪切体，针对这类抗体设计免疫原，需根据最终需要检测的目的片段进行设计，可以设计同时识别剪切体和全长，也可设计只识别全长，这类抗体有时可以用于检测血清的游离分子的残存。
总结：
综上所述，制备免疫原的方法较多，但根据抗体的最终用途，免疫原的设计策略各有不同。如何能做到事半功倍，前期需要对靶标有充分的认识，选择合理的片段进行制备，才能得到我们所需的抗体。
以上就是华安生物进行免疫原设计的一些浅显经验，希望能给正在研究的小伙伴们带来帮助，有需要的童鞋记得收藏哦~
文章中部分图片来自网络
抗体（antibody）是指机体由于抗原的刺激而产生的具有保护作用的蛋白质，是由浆细胞分泌并参与体液免疫的重要分子。众所周知，抗体被广泛用于基础科学研究、病理诊断、检测试剂盒和药物的研发。
针对不同应用的抗体来设计不同的抗原是抗体开发的关键第一步。抗原，是指能够刺激机体产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合，发生免疫效应（特异性反应）的物质。
为研发生产最优质的抗体，华安生物的小伙伴在设计上经过无数次的摸索，积累了多年经验。今天，小编就将免疫原设计策略分享给大家~
常用的免疫原有很多种，如多肽、蛋白、小分子、核酸、糖类及细胞等，但如今最常见的免疫原还是以多肽和蛋白为主。
根据抗体的应用不同，我们对免疫原的设计策略也有所不同。
01. 应用于基础科学研究的抗体研发
该类抗体的免疫原一般设计为多肽或制备蛋白的片段。目前有不同网站可以用于参考设计多肽，该免疫原设计需考虑多肽亲水性、免疫反应性及种属特异性这三点。如 http://tools.iedb.org/main/, 该网站列出了 B 细胞表位，T 细胞表位的预测。
图 1：蛋白的 B 细胞表位预测图，不同的片段其 B 细胞表位的免疫反应性有差异，其中黄色区域的表示有一定的免疫反应
通过比对不同种属的蛋白序列来比较种属特异性，以便测试设计的多肽在不同种属中的差异。
图 2：HSP27 人蛋白，小鼠蛋白和大鼠蛋白的序列比对
通过序列比对图，我们可以根据最终的抗体要求，进行序列设计。若需要抗体能同时识别不同种属，设计时则优先考虑序列一致的区域；若只需要抗体能特异性识别人蛋白或是小鼠蛋白，设计时就需要找出特异性的片段。图中*表示氨基酸在不同种属中是一致的。
图 3：蛋白的三位结构，该蛋白的三维结构，有折叠区，也有线性区域
蛋白三维结构在多肽设计考虑中也是至关重要的。常见的 B 细胞抗原表位一般会选择线性区域，而非折叠区域或螺旋区域。但 T 细胞抗原表位设计则需考虑蛋白的空间构象，将目的区域的关键氨基酸设计成多肽。
Tips：通过不同的软件或是预测网站进行多肽设计后，根据研究目的，确定所研发的抗体需要特异性识别该蛋白，或是能识别该蛋白的同源蛋白，进行序列 blast。根据 blast 的结果，预先判断所设计的多肽的同源性。
02. 应用于针对修饰性位点的抗体研发
蛋白质的翻译后修饰对生命活动有着重要作用，如磷酸化，乙酰化，甲基化等。针对该类抗体研发，设计免疫原的策略主要是设计相应的修饰位点多肽。
首先找到修饰位点，如磷酸化，根据磷酸化位点附近的氨基酸序列，设计 15-20 个氨基酸的多肽，应用软件或网站预测该磷酸化位点附近的多肽的免疫反应性，挑选反应性最高的序列作为免疫原，并进行种属特异性的检查和非同源蛋白的比对。在合成含修饰位点的多肽的同时，也需要合成该位点无修饰的多肽用于交叉检测，最终获取针对特异性位点的抗体。
Tips: 根据研究目的的不同，有时需要抗体既可识别修饰后的蛋白，又可识别无修饰的蛋白，即 pan 抗体。针对这类抗体，筛选时需要能识别两种多肽。
03. 应用于试剂盒配对用抗体
试剂盒配对用抗体通过识别蛋白不同表位来检测样品中目的蛋白的含量。因此设计此类免疫原应先调研该蛋白的整体结构、整个蛋白的大小以及是否含有剪切片段；进而根据调研的信息设计蛋白片段。或制备全长蛋白，或制备蛋白片段。抗体筛选根据阳性抗体进行表位预测，针对不同表位的抗体进行配对检测，最终获取需要的抗体对用于试剂盒后期的研发。
图 4：针对 M1102 项目蛋白免疫并获取的单克隆抗体
该实验用 6B9 作为竞争抗体。实验结果显示：克隆 A5A7 与 A4A8 的结合位点与 6B9 不同；克隆 A3F5 的结合位点与 6B9 类似；克隆 A4A7 的结合位点与 6B9 有部分相似。因此我们在进行配对实验的时候，可以优先挑选结合位点不同的抗体进行配对，如 6B9-A4A8, A4A7-A4A8 等。
04. 应用于抗体药物的研发
抗体药物的研发指针对不同的药物靶标，进行大量的抗体药物前提的研发。
用于药物研发的抗体，免疫原设计要求更为严格，目前免疫阶段采用真核表达的蛋白。抗体药物靶标主要分为两类，分泌型靶标（VEGF, IL-6, IL-17 等）和跨膜蛋白（PD-1， BCMA, EGFR 等）。
分泌型靶标，一般直接制备真核表达的蛋白用于免疫。蛋白制备后对所表达的蛋白进行功能性实验的检测、细胞的增殖作用以及与相应配体的结合实验等，以确保所制备的免疫原是有活性的蛋白。
跨膜蛋白，所制备蛋白的策略会有不同，如下图所示。
图 5：蛋白的跨膜结构
图 6：蛋白胞外区的不同结合结构域示意图
上图蛋白为 I 型膜蛋白，胞外区为蛋白的结合区，胞内为蛋白的活性区域。在设计免疫原的时候，有两个策略。一是设计胞外的结合区，制备蛋白；二是用过表达该蛋白的细胞作为免疫原。设计免疫原后，利用相应的需要设计检测的蛋白进行抗体的筛选。有时蛋白的胞外区会有不同的结构域，如 IgC 结构域，α亚基，β亚基等（图 4），针对此类蛋白，根据文献，可以找出最重要的结合结构域制备蛋白。最佳策略是制备胞外区的片段以及含特殊结构的蛋白用于免疫，效果更佳。
Tips：利用过表达细胞进行免疫，可以使蛋白以天然状态展示在细胞表面，并结合蛋白筛选和细胞筛选，这样得到的抗体，其结合活性更佳。
05. 其他特殊的抗体
对于不同研究目的需制备不同的抗体。如针对特殊结合位点的抗体研发。
图 7：某蛋白与小分子的结合示意图。
小分子与该蛋白的结合位点为一边是折叠区尾部结构，一边是线性区域，而且该小分子与蛋白的其他部分无接触。因此，设计免疫原主要以线性表位为主，同时根据折叠区和线性表位的距离，设计 T 细胞表位的多肽。
同时，有些蛋白有原始形态和剪切体，针对这类抗体设计免疫原，需根据最终需要检测的目的片段进行设计，可以设计同时识别剪切体和全长，也可设计只识别全长，这类抗体有时可以用于检测血清的游离分子的残存。
总结：
综上所述，制备免疫原的方法较多，但根据抗体的最终用途，免疫原的设计策略各有不同。如何能做到事半功倍，前期需要对靶标有充分的认识，选择合理的片段进行制备，才能得到我们所需的抗体。
以上就是华安生物进行免疫原设计的一些浅显经验，希望能给正在研究的小伙伴们带来帮助，有需要的童鞋记得收藏哦~
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