新学期，新课题：WB全能避坑指南请查收！

蛋白质印迹 (Western blot，WB)又称免疫印迹 (Immunoblotting) ，是一种用于从复杂的蛋白质混合物中识别特定蛋白质的技术。通过SDS-PAGE电泳分离蛋白质样品，利用电场作用将蛋白转移至固相载体（如PVDF膜或硝酸纤维素膜），再通过抗原-抗体特异性结合及标记二抗显色检测目标蛋白。

蛋白样本制备流程如下图所示：

蛋白提取完成后，可以用BCA法或Bradford法测定浓度，以确保上样量稳定可控。

确定每种裂解液的蛋白质浓度后，分别取等质量的裂解液，添加4xSDS Sample Loading Buffer。

混匀后，95-100°C 煮沸 5-10分钟，对样本进行还原和变性。裂解液可等量分装并在 -20°C 下储存备用。

*注意事项：一些膜蛋白或跨膜蛋白，甚至核蛋白（Rb蛋白），高温煮样会导致聚集形成多聚体或“鬼带”，导致电泳条带偏移或丢失‌。

1)将等量的蛋白和蛋白marker上样至 SDS-PAGE胶孔中。细胞或组织裂解液的总蛋白上样量为10-40 μg，纯化蛋白的上样量为10-100ng。

2)80 V 下跑胶20-30分钟，然后调整电压为120 V继续跑1-2小时，直至溴酚蓝条带跑至胶底部（或根据实际分子量大小及时调整跑胶时间）。

Tips

1)过硫/酸铵会缓慢分解，需及时新鲜配制；

2)电泳时蛋白质不仅仅从上到下扩散分离，同时会向两边扩散分离，因此在无样品孔中可加入适量1x上样缓冲液（或无关蛋白样），防止“笑脸”条带出现；

3)在不影响检测信号的前提下，尽量少上样，结果条带会更sharp；

4)电泳不要过热，过热会导致条带弥散甚至蛋白降解；5)配制好的胶，可保存于4℃冰箱约2~4周（防干燥，防冻融）。

1)准备工作：将PVDF膜在甲醇中浸泡30秒，用纯水冲洗两遍，然后用1x电转缓冲液（湿转）浸泡。将滤纸和海绵也浸泡在转膜液中。

2)拆胶：从电泳槽中取出玻片，将胶取下浸泡在转膜液中。

3)“三明治”组合：以海绵→滤纸→膜→胶→滤纸→海绵的方式，将其紧密排列，确保各个夹层之间没有气泡。

4)可采用恒流法(一般是200-300 mA，90分钟）或恒压法（一般是75V，90分钟）进行电转。

5)转移完成后，将膜取出，丽春红染色确定转印没有问题。

Tips

1)海绵每次转印过后，尽量清洗干净；滤纸尽量不要重复使用；

2)转印时间需根据蛋白大小优化，20~250kD湿转参考恒压：75V，80-90分钟；

3)转印液最多使用2次，避免产热过高导致蛋白降解；

4)大分子量蛋白推荐湿转，半干转即使延长时间也不一定能提高转膜效率（甚至可能导致降解）。

1、封闭：推荐5%脱脂牛奶（in TBST）室温封闭1小时。

2、一抗孵育：

1)将膜从封闭液中取出，用1x TBST洗膜三次，每次5分钟。
2)根据抗体推荐稀释度，用一抗稀释液稀释一抗，推荐4°C过夜孵育。

3、二抗孵育：

1)用1xTBST清洗膜三次，每次10分钟。

2)用推荐稀释度的HRP偶联二抗（可用封闭缓冲液稀释），室温孵育1小时。

1)用1xTBST清洗膜四次，每次10分钟。

2)清洗过程中，ECL底物A液和B液1:1混匀配制显色液。

3)将ECL底物和膜充分反应后，用保鲜膜将膜包裹固定在暗夹上。将膜暴露于暗照相膜或使用化学发光成像仪读取信号。

Tips
显色液的选择也非常重要，实验室最少常备两种灵敏度的ECL。显色液建议现配现用，第一次尝试新靶点时，最好先用灵敏度低的ECL尝试，如果较弱再换高灵敏度的ECL。

1)成像仪拍摄时，不建议用机器的自动曝光模式；推荐固定时间内拍摄5张或10张的模式，后期根据实际情况选择最佳的图片；

2)成像仪一般能调整图片的缩放、分辨率/灵敏度等参数。

如果初次曝光后发现：
A.条带非常强，重新加入ECL后，可以选择高分辨率、低灵敏度的模式；

B.反之，如果条带有点偏弱，也可以尝试低分辨率、高灵敏度的模式。